Події починаються з того, що міжнародний торговець зброєю Джеймс Маккален розробляє передову нанотехнологію, відому як наноміти. Ці мікроскопічні роботи здатні розщеплювати матерію та відновлювати її за попередньо запрограмованим планом. Маккален планує продати цю руйнівну зброю тому, хто запропонує найбільшу ціну. Елітна військова команда, відома як G.I. Joe, на чолі з Дюком і генералом Хоуком, має завдання зупинити МакКаллена та його організацію "Кобра".
Joe, що складається з досвідчених оперативників зі спеціалізованими здібностями, серед яких Снейк Айз, Скарлетт і Хеві Дьюті, розпочинають місію з повернення викрадених боєголовок, що містять наномітів. Переслідуючи "Кобру", вони зустрічаються з таємничою Баронесою, високопоставленою оперативницею "Кобри", яка в минулому була пов'язана з Дюком. Команда стикається з численними перешкодами та підступними ситуаціями, включаючи швидкісну погоню через Париж та підводну битву в полярних льодовиках.