Серіал розповідає про Леонардо, Мікеланджело, Донателло та Рафаеля, які намагаються впоратися зі своїми подвійними ідентичностями. Виконуючи свої обов'язки героїв, вони також стикаються з типовим тиском шкільного життя. Історія починається з того, що Черепашки розділяються, щоб протистояти лиходієві на ім'я Бішоп, який має зловісний намір знищити всіх мутантів. Ця розлука змушує їх вперше зіткнутися з власними проблемами, що врешті-решт змушує їх возз'єднатися, щоб захистити мутантський рід.
Окрім основного конфлікту з Бішопом, у серіалі будуть представлені різні сюжетні лінії, зокрема протистояння з групою водних мутантів, відомих як «Трійка з Іст-Рівер».