1957 року ветерана Другої світової, археолога зі світовим ім'ям і відомого шукача пригод Індіану Джонса (Гаррісон Форд) та його напарника Мака МакГейла (Рей Вінстон) захоплює група агентів СРСР на чолі з полковником Іриною Спалько (Кейт Бланшетт). Вони привозять Індіану в бункер у "Зоні 51" у штаті Невада і вимагають знайти контейнер з рештками прибульця, що розбився за 10 років до подій у Розвеллі. Незважаючи на зраду Мака, Інді вдається втекти. У пустелі він натрапляє на покинуте місто, яке виявляється полігоном для ядерних випробувань. Джонсу нечувано щастить: він рятується від ядерного вибуху в освинцьованому холодильнику. Після повернення додому він опиняється під підозрою у ФБР як радянський шпигун. Щоб не роздмухувати скандал, керівництво університету, в якому Джонс пропрацював 25 років, пропонує професору звільнитися за власним бажанням.
Однак сидіти без діла Джонсу не довелося. До нього звертається по допомогу молодий чоловік на ім'я Метт Вільямс (Шайа ЛаБаф). Його матір і старий друг Інді, професор Гарольд Окслі (Джон Герт), були викрадені під час пошуків кришталевого черепа в Південній Америці. Індіана згадує легенду про кришталевий череп, який вивезли з легендарного міста Акатор, або Ельдорадо. Згідно з переказами, той, хто поверне череп в Акатор, отримає надприродні сили.
У листі матері Метта є загадка стародавньою мовою індіанців. Розгадка веде Джонса і Вільямса в Перу, у знамениту долину Наска. Там вони дізнаються, що Окслі перебував у психіатричній лікарні, а потім його викрали радянські шпигуни. У кімнаті, де перебував Окслі, вони знаходять знаки, що вказують на могилу конкістадора Франсиско де Ореллана, який зник у 16 столітті під час пошуку Акатора. У його могилі вони знаходять череп, який вже явно бачив Окслі. Незабаром після цього Джонс і Вільямс потрапляють до рук людей Спалько. У їхньому секретному таборі вони знаходять Окслі та матір Метта. Нею виявляється колишня кохана Інді Маріон Равенвуд (Карен Аллен), і вона зізнається Індіані, що Метт - його син.
Спалько вірить, що череп належить прибульцям. Істота, яку вони знайшли в Неваді, також мала кришталевий череп. Вона збирається повернути череп в Акатор, щоб Радянський Союз отримав психоенергетичну зброю, нібито заховану в легендарному місті. Під час подорожі Амазонкою Інді, Маріон, Метту й Окслі вдається втекти від росіян. Їм допомагає Мак, який називає себе подвійним агентом, що насправді працює на ЦРУ.
Друзі першими знаходять місто Акатор і входять у його головний храм. Там вони знаходять скелети неземних істот, які сидять у колі на тронах. В одного з них справді не вистачає черепа. Мак усе-таки виявляється зрадником, він вказує загону Спалько дорогу до храму. Спалько повертає на місце череп і вступає в розумовий контакт з істотами. Вони відкривають їй істину, але її тіло не витримує перевантажень і вибухає. У цей момент відкривається портал в інший вимір. Індіані, Маріон, Метту й Окслі вдається втекти, тоді як солдати Спалько потрапляють у портал. Храм руйнується, і на його місці з'являється літальний об'єкт, який з величезною швидкістю зникає в небесах.