Пітер Паркер (Тобі Магуайр) - простий школяр, звичайний ботанік, що страждає від нерозділеного кохання до своєї однокласниці, чарівної Мері Джейн Вотсон (Кірстен Данст). Відносини з однолітками не складаються, однокласники або помічають його, або знущаються. Пітер Паркер сирота, він живе з небагатими дядьком і тіткою, а його єдине захоплення – фотографія. Життя підлітка круто змінюється після звичайної шкільної екскурсії, де його випадково кусає павук зі зміненою ДНК. Незабаром після цього Пітер набуває неймовірної сили і витривалості, а також виявляє в себе зовсім незвичайні здібності - він може лазити по стінах і стелях і вміє вистрілювати павутинням. Його дядько Бен Паркер гине від руки грабіжника, і Пітер розуміє, що тепер його призначення – боротьба зі злочинцями.
Водночас Норман Озборн (Віллем Дефо), батько єдиного друга Пітера Гаррі Озборна (Джеймс Франко) фінансує секретні військові розробки. Щоб переконатися в перспективності нових досліджень, він проводить експеримент на собі і перетворюється на жорстокого та безпринципного Зеленого Гобліна, здатного на все заради досягнення своїх цілей. Саме Зелений Гоблін стає головним ворогом Людини-Павука.