Після подій, що відбувалися у першій частині серії, минуло два роки. Життя Пітера Паркера (Тобі Магуайр) після того, як його вкусив павук із зміненою ДНК і він отримав незвичайні здібності не стало особливо простим: він відчайдушно намагається бути одночасно звичайним студентом коледжу та супергероєм, що вміє метати павутину та дертися по стінах.
Пітер все ще зберігає свій секрет, що йому дається нелегко. Крім того, під загрозою опиняються стосунки зі всіма близькими йому людьми. Пітера звільняють з піцерії, де він підробляв, а його подруга Мері Джейн (Кірстен Данст), яку він давно закоханий, зізнається, що збирається вийти заміж за астронавта Джона Джеймсона (Деніел Гілліс), сина головного редактора великої газети. Тітка Пітера, Мей Паркер (Розмарі Харріс), може опинитися на вулиці. Його найкращий друг Гаррі (Джеймс Франко) сумує за померлим батьком і мріє помститися Людині-Павуку. На додачу до всього, Пітер Паркер зауважує, що його особливі здібності починають пропадати. Тоді він вирішує покласти край кар'єрі супер-героя і почати жити звичайним життям, але над містом нависає чергова небезпека.
Гаррі Озборн спонсорує новий незвичайний експеримент, результатом якого стає черговий супер-лиходій: учений Отто Октавіус перетворюється на Доктора Восьминога (Альфред Моліна). Тепер Пітеру Паркеру знадобляться всі сили, щоби захистити жителів міста від нового ворога.